Microbiología/Obtención de cultivos puros: siembra y aislamiento

OBTENCION DE CULTIVOS PUROS: SIEMBRA Y AISLAMIENTO

SIEMBRA O CULTIVO: es la operación que consiste en depositar asépticamente microorganismos en un medio de cultivo

Principios Generales

1. Practicar la siembra en medios de cultivos previamente esterilizados y adecuados para la bacteria que se desea aislar 2. Emplear instrumentos estériles 3. No contaminar ni destruir los microorganismos 4. Depositar los microorganismos asépticamente en los medios de cultivo 5. Esterilizar los instrumentos empleados, inmediatamente después de cada operación

Los instrumentos empleados corrientemente en la siembra son:

1. Asa de Siembra: se utiliza alambre de platino, o alambre de una aleación niquel-cromo (nicrom) que tiene propiedades semejantes a la primera, con la ventaja de ser de menor costo. Este alambre tiene un diámetro de 0,3 a1 mm y esta sujeto a un mango o porta asa metálico o de vidrio. El alambre puede ser totalmente recto (asa en punta o aguja), recto con un anillo de aproximadamente 3 mm de diámetro en la extremidad (asa) o aplastado en el extremo (espátula). Puesto a la llama del mechero alcanza rápidamente el rojo blanco ( 1.300°C ) y también rápidamente se enfría.

2. Pipeta Pasteur: es un tubo de vidrio con una extremidad afilada u cerrada. La otra extremidad que se encuentra abierta está protegida por una mota de algodón cardé o hidrófobo.

La técnica general de siembra dependerá de:

a) Estado físico del material a sembrar ( sólido o líquido ) b) Estado físico del medio de cultivo ( agar o caldo ) c) Ambiente en el cual crece el microorganismo ( aerobiosis, microaerofilia o anaerobiosis )

SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS

Los medios de cultivo para las bacterias anaerobias poseen en general las mismas sustancias nutritivas que para las bacterias aerobias, pero es necesario privarlos del O2 libre o en disolución mediante distintos métodos:

1.- Métodos Físicos:

a) Expulsión del aire por ebullición: antes de efectuar la siembra, los medios líquidos y sólidos se llevan a ebullición en baño María con el fin de eliminar el aire. Este proceso se denomina “regeneración” de los medios. Esto evita el reoxigenamiento de los medios líquidos.

b) Reemplazo del aire por gases inertes: este método consiste en la eliminación del aire, mediante bomba de vacío, del recipiente que contiene los medios sembrados y su reemplazo por Hidrógeno, Nitrógeno, CO2, etc.

2. Métodos Químicos:

a) Sustancias reductoras tóxicas para las bacterias, por cuyo motivo no se adicionan a los medios de cultivo, sino que en un lugar adecuado del recipiente que contiene los tubos sembrados. Se utiliza principalmente Acido Pirogálico o Hidróxido de potasio

b) Sustancias reductoras no tóxicas que se agregan directamente a los medios de cultivo , por ejemplo Glucosa al 1-2%, Tioglicolato de sodio 0. 1 – 0.2%, Cistina al 0.05% entre otros.

3. Métodos Biológicos:

a) Tejidos animales que se adicionan a los medios de cultivo, como por ejemplo: carne picada, cerebro, hígado, etc.

AISLAMIENTO Y TRANSPLANTE (TRASPASO)

Cuando se realiza una siembra en medios sólidos es deseable obtener las bacterias en forma asiladas. Sin embargo, generalmente las muestras tienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (flora normal) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.

Para realizar diagnósticos microbiológicos el organismo debe ser primero aislado y mantenido puro en condiciones de laboratorio.

Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de 1 colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.

Si fuese necesario las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtener cultivos puros; es decir, presenten la misma morfología y microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria.

Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacteriana mediante el traspaso de 1 sola colonia a una batería de medios diferenciales.

El aislamiento de los microorganismos se puede conseguir por los siguientes procedimientos:

1. Métodos Mecánicos

1.1. Aislamiento por diseminación o agotamiento: consiste en efectuar estrías sobre la superficie del agar, utilizando un asa de cultivo, sin pasar 2 veces por el mismo lugar.

Técnicas de aislamiento por estriación:

Uno de los métodos utilizados es el siguiente (Figura 10): - El inoculo se extiende sobre una pequeña superficie del agar - Se flamea el asa y se trazan 3 líneas oblicuas a partir del deposito original ( sin pasar el asa 2 veces por el mismo sitio ) - Flamear el asa, girar la placa levemente en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 líneas de la misma forma anterior - Flamear el asa, girar la placa levemente en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 líneas de la misma forma anterior - Flamear el asa, girar la placa levemente en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 líneas de la misma forma anterior - Flamear el asa y trazar una estriación en forma de zig-zag sobre la superficie del agar que ha quedado libre.

Figura 10. Esquema de siembra por agotamiento.