Microbiología/Medios de cultivo
MEDIOS DE CULTIVO
Los microorganismos por lo general pueden vivir y multiplicarse sobre substratos nutritivos preparados en el laboratorio, denominados medios de cultivo. Los Medios de Cultivo son preparados estériles que contienen sustancias necesarias para el desarrollo de los microorganismos.
Todos los microorganismos requieren agua, carbono, nitrógeno, hidrógeno, calcio, fósforo y hierro como elementos vitales. Los microorganismos exigentes requieren además factores de crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas y otras sustancias que no son capaces de sintetizar.
CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
1.Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos (tales como aminoácidos, carbohidratos, polialcoholes, vitaminas, minerales).
2.Tener un pH que permita un desarrollo óptimo, por lo general las bacterias patógenos necesitan un pH neutro o ligeramente alcalino (7.0 – 7.4), en cambio las levaduras y hongos requieren un pH ácido (5.0).
3.Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones asépticas.
4.Estar protegidos de la contaminación ambiental por tapones de algodón cardé, tapones de goma, tapas metálicas o roscas.
UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
1.Aislamiento de bacterias desde una muestra o material patógeno (secreción purulenta, orina, órgano, fecas, etc.) o de un alimento (leche, carne, etc.)
2.Estudio morfológico de las colonias.
3.Conservación de cepas identificadas (colección de cepas microbianas o cepario).
4.Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades bioquímicas en medios diferenciales.
5.Obtención de toxinas o investigación de sus características.
6.Cultivo y cosecha de bacterias para la elaboración de productos biológicos (vacunas, antígenos, bacterinas, toxoides, etc.).
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
SEGÚN SU ESTADO FÍSICO
1. Medios Líquidos: se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de células estresadas. En determinadas ocasiones no se pueden sustituir por los medios sólidos, por ejemplo en la síntesis de exotoxinas, pigmentos, enzimas, etc. - Ejemplo: Agua peptonada, Caldo común, Caldo Cerebro Corazón, Caldo Saboureaud, etc.
2. Medios Sólidos: se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formación de colonias sobre la superficie del medio de cultivo y para el estudio de la morfología de las colonias, lo que no permiten los medios líquidos. Se diferencian porque tienen una sustancia de sostén, que puede ser agar-agar. - Ejemplo: Agar Común, Agar SS, Agar Cerebro Corazón, Agar Saboureaud, etc.
3. Medios Semisólidos: se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un menor porcentaje de agar, por lo que no solidifican totalmente a la temperatura ambiente. - Ejemplo: Agar MIO, Agar SIM.
Los medios sólidos tienen generalmente agar–agar como agente solidificante, espesante o gelificante. El agar-agar es una sustancia hidrofílica de carácter coloidal procedente de diversas especies de algas marinas, especialmente del géneroGelidium, que tiene la propiedad de formar un gel. Químicamente el agar-agar es un polisacárido de cadena larga, dependiendo de su tamaño el poder gelificante.
agua fría, se disuelve solamente a temperatura de ebullición, se mantiene en forma viscosa a 60–80 °C y solidifica en forma de un gel estable a 40–45 °C. Resiste perfectamente la esterilización a 121 °C y por su capacidad de retener agua no se deshidrata fácilmente, lo que permite almacenar los medios por un largo período de tiempo a 5 °C.
La gelatina no puede reemplazar al agar en la preparación de medios sólidos, ya que descompuesta por muchos tipos de bacterias. Se añade a los medios de cultivo para estudiar si las bacterias son capaces de degradarla (presencia de enzimas gelatinasas).
SEGÚN SU UTILIDAD PRACTICA
1. Medios corrientes, comunes o básicos 2. Medios especiales - Medios mejorados - Medios selectivos o de diagnóstico - Medios diferenciales o indicadores
1. MEDIOS CORRIENTES: son aquellos medios apropiados para el cultivo y mantención de la mayoría de las bacterias. Sirven de base para la preparación de los medios especiales. - Ejemplo: Caldo común, Agua peptonada, Agar nutritivo, etc.
2. MEDIOS ESPECIALES: son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva, sirven para el cultivo de bacterias muy exigentes. Contienen en su formulación sustancias inhibidoras para ciertas bacterias, que permiten el aislamiento y diagnóstico precoz de aquellas bacterias que nos interesan por ser los agentes etiológicos de las enfermedades infecciosas. También pertenecen a este grupo aquellos medios que por adicción de sustancias químicas determinadas, facilitan el diagnóstico por características bioquímicas de algunas especies microbianas.
Los medios especiales se clasifican en:
2.1. Medios Mejorados: se obtienen añadiendo a los medios corrientes sustancias de mayor valor nutritivo, que tienen el efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de bacterias exigentes (Ej. Estreptococos, Corynebacterium).
Las sustancias añadidas pueden ser: sangre desfibrinada (conejo, cordero o caballo), suero sanguíneo (equino), suero fetal bovino, huevo, cerebro, corazón, trozos o extracto de hígado, carne o levadura, etc.
La mayoría de estas sustancias por ser proteicas coagulan con el calor, lo cual impide que sean esterilizadas en autoclave. Deben por lo tanto ser esterilizadas por filtración o ser agregadas a los medios previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa asepsia. Ejemplo: Agar Sangre, Agar Cerebro Corazón, etc.
2.2 Medios Selectivos: generalmente el microorganismo patógeno causante del cuadro infeccioso que se desea aislar a partir de la muestra, no se encuentra puro sino que convive con otras especies sin interés diagnóstico. Así por ejemplo es frecuente que las fecas, orina, exudados, alimentos, agua, etc. estén altamente contaminadas con bacterias saprófitas que por su desarrollo exuberante en los medios de cultivo corrientes, inhiben el crecimiento o enmascaran la presencia del agente patógeno buscado.
Los medios selectivos se caracterizan por estimular el desarrollo de ciertas especies bacterianas y a la vez inhibir el desarrollo de otras especies, lo que permite es aislamiento y diagnóstico de las bacterias con facilidad y rapidez. Estas características se obtienen por la adición de sustancias tales como colorantes de anilinas, sales biliares, antibióticos, etc. Ejemplo: Agar Brucella, Caldo Selenito Cistina, etc.
2.3 Medios Indicadores o Diferenciales: son medios comunes o mejorados, con adicción de ciertas sustancias que ponen de manifiesto determinadas propiedades bioquímicas, inherentes a algunas especies bacterianas, como por ejemplo: producción de gas, H2S, de ácidos, de sustancias alcalinas, acción proteolítica, acción lipolítica, etc.
Estas sustancias o indicadores permiten diferenciar rápidamente una especie microbiana de otra semejante; por este motivo se denominan medios indicadores o diferenciales. Ejemplo: Agar Baird Parker, Agar Rambach, etc.
a) El agar Mac Conckey se utiliza para el aislamiento e identificación de Escherichiacoli. Es un medio mejorado ya que tiene Cristal Violeta y Sales Biliares que inhiben el desarrollo bacterias Gram positivas.
b) El Caldo Tripticasa Soya es un medio corriente, ya que permite el desarrollo de una amplia variedad de bacterias. Puede hacerse más selectivo para el desarrollo de Staphylococcusaureus, si se le agrega un 10% de NaCl, lo que no permite el crecimiento de otras bacterias saprófitas.
SEGÚN SU ORIGEN
1. Origen animal ( Caldo Cerebro Corazón) 2. Origen vegetal ( Caldo papa, Caldo Levadura ) 3. Sintéticos ( Medios deshidratados )
Los medios de cultivo comerciales deshidratados son productos a los cuales se le ha eliminado el agua y todas las interferencias de tipo químico, con un pH ajustado, que se han controlado física, química y bacteriológicamente. Es decir es un producto estandarizado.
COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Según la finalidad, los medios de cultivo pueden tener en su composición los siguientes ingredientes:
1) Aminoácidos, hidrolizado de proteínas ( peptonas ) 2) Extractos 3) Productos biliados 4) Carbohidratos 5) Productos bioquímicos 6) Colorantes e indicadores
1) Productos Bioquímicos A los medios de cultivo se les agrega generalmente una diversa variedad de sustancias bioquímicas, que pueden tener el efecto de estimular el desarrollo bacteriano o ser agentes selectivos, como es el caso de los antibióticos.
2) Colorantes e indicadores Estas sustancias se utilizan en los medios selectivos y diferenciales. Los colorantes actúan como agentes bacteriostáticos o como inhibidores del crecimiento. Se utilizan principalmente: Fucsina básica, Verde brillante, Verde de Malaquita, Cristal Violeta, Eosina, Azul de Metileno, Tionina, etc.
Los indicadores son sustancias químicas que varían de color según el pH del medio. Se utilizan en los medios diferenciales y permiten visualizar, por cambios de color del medio de cultivo o de las colonias, la ocurrencia de distintas reacciones bioquímicas.
Indicador Ácido Neutro Alcalino
Rojo Fenol Amarillo (6.8) Rojo Fucsia (8.4) Rojo Neutro Amarillo (6.8) Rojo Amarillo (8.0) Rojo de Metilo Rojo fuerte (4.4) Rojo Amarillo (6.0) Azul Bromotimol Amarillo (6.0) Verde Azul (7.7) Púrpura BC Amarillo (5.2) Azul Púrpura (6.8) Fenolftaleína Incoloro (8.3) Rosado Fucsia (10)